У новому дослідженні вчені із University of Oregon’s Phil and Penny Knight Campus for Accelerating Scientific Impact використали дизрупцію старт-кодону за допомогою редагування гену CRISPR-Cas9, щоб попередити розвиток рогівкової дистрофії Фукса у мишей. Це перша демонстрація використання техніки, що має назву дизрупція старт-кодону, для лікування генетичного розладу в постмітотичній тканині, і вона має великий потенціал до того, щоб стати революцією у лікуванні дистрофії Фукса і замінити собою трансплантацію рогівки. Це також може призвести до появи нових методів лікування інших генетичних захворювань, які вражають клітини, що вже не діляться.

Ця стаття, що має назву “Start codon disruption with CRISPR/Cas9 prevents murine Fuchs’ endothelial corneal dystrophy”, була очолена професором Balamurali Ambati, і опублікована в журналі eLife.

У цій статті детально подані результати 8-річного дослідження, що стосується захворювання, яким страждає приблизно 1 людина на 2000 в усьому світі. Рогівкова дистрофія Фукса призводить до відмирання ендотеліальних клітин рогівки, що викликає її набряк, і може призвести до зниження гостроти зору, болі та, в кінцевому результаті, до сліпоти.

“Багато людей працюють над тим, щоб запобігти смерті цих клітин, але, зрештою, виклик полягає в тому, що це постмітотичні клітини – ви народжуєтесь із клітинами, які будуть із вами все життя, а коли вони починають відмирати, то це стає проблемою”, – каже Ambati.

Зараз єдиним методом лікування дистрофії Фукса є трансплантація рогівки – велика операція, яка пов’язана із супутніми ризиками та численними потенційними ускладненнями, такими як приєднання інфекції, відторгнення трансплантату та глаукома. В США ця хвороба є основною причиною трансплантації рогівки, і хоча трансплантати рогівки легко доступні в цій країні, в більшій частині світу їх не вистачає.

Дослідники зосередились на підтипі захворювання, який рано починається і вражає пацієнтів наприкінці їх 30-ти років або на початку 40-ка. І свою увагу звернули на одиничну мутацію в колагеновому білку, відомому як COL8A2.

“Раніше було продемонстровано, що якщо ви виб’єте цей ген (COL8A2), то рогівка почуває себе добре, – каже Ambati, – Саме ця мутантна форма цього білка викликає проблему”.

Дослідники намагались перевірити, чи зможе нокдаун білка запропонувати нову терапевтичну стратегію для хвороби. Вони звернулись до редагування гена CRISPR-Cas9, щоб націлитись на патогенний білок у дорослих мишей із мутацією, однак зіткнулися із проблемою використання цієї технології на постмітотичних клітинах.

“У постмітотичній клітині дуже важко або майже неможливо викликати гомологічну рекомбінацію. Тож ми повинні продумати інші шляхи для досягнення нашої мети”, – сказав Hironori Uehara, дослідник із лабораторії Ambati та головний автор статті.

Uehara розробив інноваційний засіб блокування експресії гена COL8A2 шляхом націлювання на його старт-кодон. Старт-кодон – це місце ініціації синтезу білка. Порушення стартового кодону може призвести до припинення експресії білка. Націлювання на інші ділянки також може припинити експресію білка шляхом здвигу рамки зчитування, однак це може викликати іншу небажану експресію білка. Чим далі знаходиться мішень від старт-кодону, тим вищий ризик неправильних мутацій, які можуть призвести до синтезу життєздатних мутантних білків із невідомою активністю.

“Ми визначили, що ми можемо порушити старт-кодон і тим самим вибірково виключити експресію цього білка, доставляючи генну терапію лише до рогівки”, – сказав Ambati.

Вчені проводили дослідження за допомогою аденовірусу, що кодує SpCas9 і доставляє РНК шляхом ін’єкції в передню камеру ока мишей, безпосередньо до ендотеліальних клітин рогівки. У дослідженні, яке вивчало безпечність терапії, було виявлено, що вона не впливає на оточуючі тканини. Також вони вивчали гени, які не були мішенями для терапії, щоб переконатися, що вони не зазнали впливу, і визначили максимальну толерантну дозу, яка була б безпечною для сітківки, райдужки та інших частин ока.

Дослідницька група показала, що вони не тільки можуть зберегти щільність і структуру ендотеліальних клітин рогівки, а ще й врятувати їх функції. Під час тестів, в ході яких був викликаний набряк рогівки, вченим вдалося зробити дивовижні вторинні відкриття. Взаємодія води із рогівкою не викликала набряку, як очікувалось. Натомість, вони визначили, що набряк був викликаний потраплянням водянистої вологи в рогівку через ендотелій (її внутрішня сторона), а отже вплив гіперосмолярного розчину на поверхню рогівки після видалення епітелію призводив до найсильнішого набряку.

Ця робота закладає основу для подальших досліджень, присвячених доцільності використання нокдауну гена COL8A2 для терапії дистрофії Фукса у тварин, приматів та, врешті-решт, людей. Зменшення потреби у трансплантації рогівки через дистрофію Фукса може побічно допомогти іншим пацієнтам, які потребують рогівкових трансплантатів, як зазначає Ambati. Майбутні дослідження також можуть виявити вплив опосередкованого Cas9 нокдауну гена на таргетинг інших генетичних захворювань постмітотичних клітин із одиничною мутацією, включаючи неврологічні захворювання, імунні захворювання та певні патології, які уражають суглоби.

Оригінальна стаття була опублікована на порталі Medical Xpress 3 серпня 2021 року.